مقاله مقدمه‌اي بر بيوتكنولوژي انتقال ژن در ماهي

مقاله مقدمه‌اي بر بيوتكنولوژي انتقال ژن در ماهي در 50 صفحه ورد قابل ويرايش
فهرست مطالب

عنوان صفحه

بخش اول: دست كاريهاي ژني در ماهيان

مقدمه................................................................................................................

1-1- به كار گيري پروموتر از ژن ماهيان.....................................................

2-1- بيان ژن هورمون رشد ماهي در باكتري...............................................

3-1- انتقال ژن به تخم ماهي از طريق ميكروپيل با ميكروپيپت.....................

4-1- انتقال ژن از طريق اسپرم با انكوبه كردن آن در سيستم بافري...........

5-1- انقال ژن از طريق اسپرم با الكتروپورشن در سيستم بافري................

6-1- انتقال ژن به تخم ماهي از طريق الكتروپورش.....................................

7-1- انتقال ژن به تخم ماهي از طريق ميكروپيل با ميكرواينجكشن..............

8-1- بررسي امكان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد.............................
بخش دوم : دست كاريهاي كروموزومي در ماهيان

1-2- دست كاريهاي جنسي.............................................................................

1-1-2- دست كاريهاي جنسي با تكنيك ژينوژنز............................................

2-1-2- دست كاريهاي مجموعه كروزومي به وسيله تكنيك اندروژنز..........

2-2- پلوئيدي...................................................................................................

1-2-2- تريپلوئيدي.........................................................................................

2-2-2- تتراپلوئيدي........................................................................................
بخش سوم: كلونينگ

مقدمه................................................................................................................

1-3- ايجاد كلون به وسيله دوژينوژنز متوالي................................................

2-3- كلون كردن به وسيله تركيبي از اندروژنز و ژينوژنز...........................

3-3- جابجايي هسته........................................................................................

4-3- جابجايي سلولهاي سوماتيك جنيني به جنين ديگر.................................

5-3- دورگه گيري..........................................................................................

4- منابع............................................................................................................




بخش اول: دست كاريهاي ژني در ماهيان

مقدمه:

يكي از زمينه هاي كه امروزه بيوتكنولوژيست ها روي آن تحقيق مي كنند ايجاد گونه هاي ترانسژنيك است. طبق تعريف ترانسژنيك موجودي است كه، داراي DNA نو تركيبي باشد. به طوري كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركيب بيان مي شود. بيان ژن خارجي يكي از جنبه هاي توليد ترانسژنيك و انتقال DNA به زاده هاي هدف بعدي مي باشد. در اين زمينه تكنيك ميكرواينجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولين بار به وسيله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در اين تكنيك يك لوله مؤئين شيشه اي را براي وارد كردن DNA نو تركيب به پيش هسته نريا با سيتوپلاسم تخم لقاح يافته موش به كار گرفتند. در همين سال ميكروانجكش مستقيم DNA نو تركيب در شرايط آزمايشگاهي جهت ايجاد حيوانات ترانسژنيك مورد استفاده قرار گرفته است. طوري كه ژن را از اين طريق وارد تخم هاي لقاح نيافته يا لقاح يافته موجوداتي نظير جنين توتياي دريايي،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژني شامل پرتومتالوتيونين موش و ژن هورمون رشد انساني را به ناحيه مركزي صفحه زاياي تخم هاي لقاح يافته ماهي طلايي تزريق كردند و قسمتي از اين ژن را در DNA ماهيان مشاهده كرند. در همين سال روكونس (Rokkones) تكنيك ميكرواينجكشن دو مرحله اي بر روي تخم آزاد ماهيان را شرح داده است. در اين تكنيك ابتدا به كمك يك وسيله نوك تيز فلزي در قطب حيواني سوراخي ايجاد شده و از طريق اين سوراخ محلول حاوي DNA نو تركيب به كمك پي پت ريز تخم شدند به طوري كه به كيسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسميدهاي كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روي قزل آلاي قهوه اي رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجي همراه با ملكولهاي DNA ميزبان پيشنهاد شده كه اين ژن به داخل ژنوم ماهي وارد شده است. محققان به ورش دستي يا از طريق هضم آنزيمي از جمله با تريپسن كوريون را برداشته و تزريق ميكرواينجكشن انجام دادند. در همين سال اوزاتا (Ozata) ماهي كوچك مدوكا را به عنوان مدلي براي ترانسژنيك مطرح كرد. او پلاسميدهاي حاوي ژن كريستالين جوجه را به هسته تخم ها از طريق ميكرواينجكشن وارد كرد. به علت كوريون سفت در تخم لقاح يافته تعدادي از ماهيان استفاده از ميكرواينجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زيادي است. به همين منظور روشهايي جهت غلبه بر اين مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بريم (Brem) و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي تخم هاي تيلاپيا تزريق كردند و رشد بچه ماهيان طي 90 روز بررسي شد. مشابه اين تحقيق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همين سال بر روي ماهي آزاد اتلانتيك انجام شد. همچنين تكنيكهاي ديگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شليك ذرات ژن Shatagun بر روي تخمك و طراحي ليپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. ميكر واينجكشن نياز به مهارت زيادي دارد و از طرفي سرعت آن كم و هزينه و تجهيزات آن زياد است و مستلزم زحمات و زمان زيادي براي ايجاد تعداد زيادي از ما هيان ترانسژنيك است علاوه بر اين از ديگر مشكلات آن اين است كه در تخم هاي القاح يافته اغلب ماهيان هسته به وسيله ميكرسكوپ قابل روئيت نيست بنابراين DNA را به سيتو پلاسم تزريق مي كنند.

در مجموعه تحقيقات انجام شده، ميزان باقي ماندگي جنين هايي كه مورد تزريق قرار گرفته اند بين 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و كارآيي ميزان بيان ژن بين 3 تا 70 درصد بوده است. باقي ماندگي جنين ها و كارايي بيان ژن وابسته به فاكتورهايي نظير سيستم بافري، غلظت DNA و روش هاي مورد استفاده در تزريق مي باشد. لذا در مراحل بعدي غلبه بر اين مشكلات مورد توجه قرار گرفت به طوري كه ضمن ساده كردن تكنك و كم كردن هزينه ها كارآيي را افزايش مي دهند تا در عمل بتوان در تكنولوژي تكثير و پرورش آبزيان تعداد زيادي از ماهيان ترانسژنيك را ايجاد كرد. بنابراين روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بكارگيري اسپرم به عنوان يك ناقل مسئله جديدي نيست بلكه در سال 1971 براكت (Brackett) با وارد كردن ژن خارجي به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فريمن (Fareeman) بر روي ماكيان اين تحقيق را انجام داده اند و در سال 1989 لويترانو (Lavitrano) اين تكنيك را بر روي موش به كار گرفته است. در سال 1992 كهو (Khoo) تكنيك استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد كردن ژنهاي جديد به ماهي زبر به كار گرفت. همچنين در سال 1993 ايكسي (Xie) و همكاران جزئيات انتقال ژن از طريق اسپرم به كمك التروپورشن (Electroporation) بر روي ماهيان لوچ (Loach) و كاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سين) Sin و همكاران انتقال ژن به ماهي چنوك (Chinook) را با همين تكنيك شرح دادند. در اين نوشتار جزئيات دستكاريهاي ژني در ماهيان با ذكر مثالهايي بررسي شده است.

1-1- به كار گيري پروموتر از ژن ماهيان
گزارشهاي اندكي در ارتباط با تحقيقات به كارگيري پروموتر از ماهي در دسترس است. در ماهي قزل آلاي رنگين كمان دو فرم مشابه از ژنهاي متالوتيونين بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بيان ژن گزارشگر در محيطهاي كشت سلولي است. ولي درباره اين ويژگي پروموترژن B در سلولهاي ماهي اطلاعات كمي وجود دارد. به منظور طراحي و كتورهاي مناسب براي ما هي و مطالعه تنظيم بيان ژن در داخل بدن و شرايط آزمايشگاهي پروموترن ژن B متالوتيونين ماهي قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بيان ژن در لاينهاي سلولي انسان و ماهي توسط هونگ (Hong) به كار گرفته شد. به همين منظور وكتور بنام PtMTb – CAT كه داراي 6/4 كيلوباز است طراحي گرديد. حدود 261 حفت باز وكتور مربوط به پروموترژن B متالتيونين قزل آلاي رنگين كمان (tMTb) كيلو باز آن ژن كلرامفنيكل استيل ترانسفراز (CAT) و سيگنال پلي ادنيلاسيون ويروس SV40 و همچنين 7/2 كيلو باز آن قطعه اي مربوط به پلاسميد PUC18 بوده است همچنين طراحي آن بر پايه ساختمان pBL – CAT تكميل شده بود. به طوري كه طراحي BL پرايمري داراي سكانس اوليگونكلئوتيدي بر اساس رديف نكلئوتيدهاي سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهي قزل آلا بوده و داراي محل ويژه اي جهت برش توسط آنزيم EcoRI بوده است. همچنين در ساختمان پلاسميد ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازي پروموتر tMTb در جلوي ژن CAT در ساختمان CAT pBL- قرار گرفته است. در كنار اين چهار وكتور ديگر طراحي گرديد، كه شامل pBL-CAT2-1 كه در آن پروموتر تيميدين كيناز (TK) ويروسي در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 كه در آن پروموتر TK برداشته بود طراحي شد pTK-CAT2E-3 كه در پلاسيميد PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تكراري از اينهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتداي ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 كه تعداد 850 جفت باز داراي محل ويژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتيونين IIA انساني (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان
pBL-CAT3 اضافه شده بود اين وكتورها به روي 4 لاين سلولي ماهي و يك لاين انساني به كار گرفته شدند. طوري كه در آن سلولها با ميزان 5/3 پيكومولار از DNA پلاسميد آلوده شدند جزئيات نتايج در جدول شماره يك آمده است.

جدول 1- سنجش فعاليت پروموتر در يك لاين سلولي انسان و چهار لاين سلولي ماهي

-8- بررسي امكان وراثت ژن منتقل شده به نسل هاي بعد

كهو و همكاران در سال 1992 پلاسميد pUSVCAT كه حاوي ژن گزارشگر CAT بود از طريق اسپرم به ماهيان زبراتو منتقل نموند. نتايج حاصله نشان داد كه پلاسميد حاوي ژن در ميان زاده هاي نسل اول و دوم ظاهر شده است. پلاسميد در طي لقاح اسپرم با تخمك قابليت انتقال به نسل جديد را داشته است. همچنين در بسياري از حالات پلاسميد معرفي شده در ميزبان اغلب به صورت خارج كروموزومي باقي مي‌ماند. البته قطعاتي از DNA الگو ممكن است وارد ژنوم شوند و حالت غير موزائيك در يكي از مجموع 7 والد ترانسژنيك ماهي زبرا ديده شد. ولي شش تاي ديگر حالت موزائيك داشته اند.

تصوير 14- نتايج انتقال ژن از طريق اسپرم با سيستم انكوبه كردن در بافر روي ماهي زبرا كه در آن 7 ماهي ترانسژنيك با ماهيان غير ترانسژنيك لقاح داده شدند. P (والدين) ، F1 (نسل اول) ،‌F2 (نسل دوم)،‌دايره مولد ما ده، مربع مولد نر ،‌مثلث جنسيت ناشناخته رنگ سياه نشانه ترانسژنيك است.

علاوه بر اين دولين (Delin) و همكاران در سال 1995 ژن هورمون رشد ما هي آزاد چنوك با پروموتر ضد انجماد ماهي روغني اقيانوس (Ocean pout) را به ماهي آزاد كوهو (Coho) منتقل نموند. نشان داده شد كه، ژن منتقل شده در نسل اول روي رشد ماهيان اثر داشته است. در ادامه اين تحقيق 5 تا از ماهيان نر ترانسژنيك توليد شد كه حاوي ژن منتقل شده بوند. (OPAFPGHC) و به حد بلوغ رسيدند براي لقاح تخمكاري ماهيان طبيعي مورد استفاده قرار گرفتند زادهاي حاصله بعد از مرحله لاروي يعني در شروع مرحله الوين (Alevins) دو فنوتيپ مشخص را نشان دادند. به طوري كه اكثر بچه ماهيان رنگ طبيعي قهوه اي مشابه ماهي والد داشته اند در حالي كه تعداد ديگري از آنها داراي فنوتيپ رنگ سبز بوند. اگر چه اين اختلاف رنگ زود گذر بود و در مرحله بعد يعني فراي (Fry) رنگ قهوه اي در ماهيان غير ترانسژنيك كمتر مي شد. بررسيها DNA با PCR نشان داد كه، فنوتيپ سبز با حضور ژن OPAFPGHC مرتبط است بنابراين در تحقيق از رنگ سبز به عنوان شاخصي براي تشخيص ورود ژن استفاده شد بررسيها ثابت كرد كه نرهاي ترانسژنيك قادر به انتقال ژن وارده از طريق جرم لاين به سلولهاي اسپرم مي باشند بنابراين پيشنهاد شده كه ممكن است، ورود DNA منتقل شده به كروموزمي ميزبان صورت گرفته باشد يا اينكه همانند سازي DNA آن به صورت خارج كوموزمي صورت گرفته و در طي تقسيمات ميوزي به سلولهاي بعد منتقل شود. فركانس انتقال آن در اين آزمايشات كم و در حد زير 20 درصد بوده است. اين فركانس پائين ناشي از اين است كه 50 درصد از سلولهاي جرم لاين اوليه كه وارد مرحله تقسيم ميوزي شده اند ژن منتقل شده را دريافت كرده اند. فركانس هاي پائين تر از اين ممكن است از اين مسئله ناشي شده باشد كه تمام سلولهاي اسپرم ژن منتقل شده را دريافت نكرده باشد. در حقيقت يك موزائيسم به طور گسترده در ارگانيسم هاي موجود ترانسرنيك اتفاق مي افتد طوري كه در بافتهاي سوماتيك مشابه جرم لاينها اين موزائيسم مشاهده مي شود. در ارتباط با ظهور رنگ سبز در مرحله الوين در ماهيان ترانسژنيك پيشنهاد شده كه ناشي از تشديد رشد و نمو و رنگ زايي (Pigmentation)بوده است. پيش از شروع تغذيه به افزايش رشد طولي و وزني ماهيان ترانسژنيك با توجه اينكه هيچ منبع انرژي كمكي داده نشده است. منجر به اين نتيجه گيري شده است كه، افزايش بيان ژن هورمون رشد ممكن است ميزان رشد را تحت تأثير قرار دهد يا بر كارايي تبديل انرژي ذخيره در زرده تخم اثر گذارد. اينكه آيا افزايش رشد به طور مسقيم ناشي از عملكرد هورمون رشد است يا به واسطه اي نظير عمل فاكتور شبه انسولين (Insulin like – growth factor) GF و همكارانش در سال 1992 پيشنهاد كردند كه بيان ژن IGF در طي مرحله لاروي آزاد ما هيان در رشد اوليه نقش دارد. همچنين نشان داده شده كه، تخم هاي آزاد ماهيان از منشاء مادري داراي هورمون تيروئيد است كه در رشد جنين نقش دارد به طوريكه در اين ماهيان هورمون تيروئيد T3 به طور وضوع سبب افزايش رشد مي شود. علاوه بر اين مشخص شده است كه هورمون رشد در دوران جنيني با اثر روي فعاليت آنزيم T4 دايو ديناز De- iodinase سبب افزايش تبديل T4 به T3 و در نتيجه افزايش رشد مي‌شود و IGF شبيه مهره داران عالي سبب افزايش رشد كارتيلاژ مي شود.