تحقیق بررسی تكوين يك روش گاز كروماتوگرافي براي تعيين مقدار آمانتادين در مايعات بيولوژيك

تحقيق بررسي تكوين يك روش گاز كروماتوگرافي براي تعيين مقدار آمانتادين در مايعات بيولوژيك در 60 صفحه ورد قابل ويرايش

چكيده

در اين تحقيق يك روش ساده و كم هزينه به منظور تعيين مقدار آمانتادين در سرم با استفاده از دستگاه گاز كروماتوگراف طراحي گرديد.

در اين روش از گاز حامل نيتروژن ، ستون OV17 و دتكتور FID به همراه استاندارد داخلي پسودوافدرين استفاده شد. نمونه ها توسط اسيد پركلريك پروتئين زدايي شده و عمل استخراج توسط اتر انجام گرديد كه بازيافت روش كامل بود.

در شرايط مذكور پيك آمانتادين ،‌استاندارد داخلي از يكديگر و مواد آندوژن به خوبي جدا گرديد. ضريب تغييرات درون روزي و بين روزي روش آناليز در حد قابل قبول بوده و حد آشكارسازي روش 8/0 محاسبه شد.

واژه هاي كليدي: آمانتادين ،‌ساس ،‌پلاسما

پيشگفتار

آمانتادين دارويي ضد ويروسي است كه داراي خواص آنتي پاركينسوني است

بيماري پاركينسون چهارمين بيماري شايع نورودژنراتيو در افراد مسن است . كه 1% افراد بالاي 65 سال و 4/0% افراد بالاي 40 سال را تحت تأثير قرار مي‌دهد . سن متوسط شروع حدود 57 سال است . ( 1 )
ايتولوژي و پاتوفيزيولوژي :

در پاركينسون اوليه ، نورونهاي جسم سياه و ساقه مغز از دست مي‌ روند كه دليل آن شناخته نشده است . از دست رفتن اين نورنها باعث كاهش نوروترنسمي‌تر دو پامين در اين مناطق مي‌ شود . شروع معمولاً بعد از 40 سال است .

پاركينسونسيم ثانويه ، در اثر بيماريهاي ايديوپاتيك دژنراتيو ، داروها ، يا توكسين ها ايجاد مي‌ شود . شايع ترين دليل پاركينسونيسم ثانويه مصرف داروهاي آنتي سايكوتيك و رزرپين است كه بوسيله بلوك رسپتورهاي دو پامين باعث پاركينسون مي‌ شوند . دلايل ديگر عبارتند از مونواكسيد كربن مسمومي‌ت با منگنز ، هيدروسفالوس ، تومورها و انفاركت هايي كه مغز مي‌اني را تحت تأثير قرار مي‌ دهند . ( 1 )

داروهايي كه سبب ايجاد سندرم پاركينسونيسم مي‌ شوند يا آنتاگونيست رپستورد و دوپامين هستند ( مثل داروهاي آنتي سايكوتيك ) ، يا سبب تخريب نورونهاي دوپا منيرژيك در نيگرو استر يا تال مي‌ شوند . ( مثل MPTP ) ( 2 )
علائم و نشانه هاي باليني :

در 50 تا 80 درصد بيماران ، بيماري بي سرو صدا و غافلگيرانه با 4 تا 8 HZ ترمور ( Pill – rolling ) يك دست شروع مي‌ شود . ترمور و لرزش در حال استراحت بيشترين مقدار است و در حال حركت كمتر مي‌ شود . و در هنگام خواب ناپدپد مي‌ شود . و با فشارهاي روحي و خستگي بيشتر مي‌ شود . معمولاً دست ها و بازوها و پاها بيشتر تحت تأثير قرار مي‌ گيرند . و به همين ترتيب فك ، زبان ، پلك هم مي‌ توانند تحت تأثير قرار بگيرند . اما صدا لرزش پيدا نمي‌ كند . در خيلي از بيماران فقط ريجيديتي رخ مي‌ دهد . و لرزش وجود ندارد . سفتي پيشرفت مي‌ كند و حركات كند مي‌ شود . ( برادي كاردي ) يا كم مي‌ شوند ( هيپوكينزيا ) و يا شروع حركات سخت مي‌ شود ( آكينزيا ) .

كه سختي و هيپوكينزي ممكن است منجر به درد و احساس خستگي شوند . صورت شبيه ماسك مي‌ شود . با دهان باز و ناپدپد شدن برق چشم ها كه ممكن است بادپرسيون اشتباه شود . راه رفتن مشكل مي‌ شود . فرد به اين سو و آن سو حركت مي‌ كند و خودش را مي‌ كشد . قدم ها كوتاه و بازوها در كنار كمر ثابت اند و حركت نمي‌ كنند. ( 1 )
درمان

بيماري پاركينسون معمولاً پيشرونده است و منجر به ناتواني فزاينده مي‌ شود مگر اينكه درمان موثر انجام گيرد . غلظت دوپامين كه بطور طبيعي در هسته هاي قاعده اي مغز بالا مي‌ باشد در پاركينسونيسم كاهش مي‌ يابد . تلاش هاي دارويي براي تقويت فعاليت دوپامينرژيك با آگوسيت هاي دوپامين توفيقاتي در تخفيف تعداد زيادي از علايم كلينيكي اين عارضه داشته است . يك رويكرد ديگر كه مكمل روش قبل است عبارتي از ايجاد تعادل طبيعي بين تأثيرات كولينرژيك و دوپامينرژيك روي هسته هاي قاعده اي توسط داروهاي آنتي موسكاريني مي‌ باشد . ( 2 )
2 ـ 1 ـ فارماكوكينتيك :

جذب : به راحتي و اغلب به طور كامل از دستگاه گوارش جذب مي‌ شود . يك دوز mg100 خوراكي آن سطح سرمي‌ در مدت 8 ـ 1 ساعت ايجاد مي‌ كند( 6 ) اوج غلظت پلاسمايي 4 ساعت بعد از‌مصرف ايجاد مي‌ شود. (4 و5)

حداكثر غلظت بافتي هنگامي‌ كه دوز mg100 هر 12 ساعت مصرف شود در مدت 48 ساعت ايجاد مي‌ شود ( 6 )
انتشار :

بعد از مصرف خوراكي آمانتادين در بافتهايي مانند قلب و كليه و كبد و شش ها يافت شده است . از جفت و سد خوني ـ‌‌ مغزي عبور مي‌ كند و همچنين به شير ترشح مي‌ شود . پروتئين با يندينگ آن در حدود 67% است . ( 4 )
دفع :

بيشتر دارو به صورت دست نخورده از طريق فيلتراسيون گلومرولي دفع مي‌ شود . هر چند متابوليت استيله هم در ادرار رديابي شده است . (‌4 )

در حدود 56% دوز به صورت دست نخورده در مدت 24 ساعت در ادرار وارد مي‌ شود و در حدود 86% آن در طي 4 روز وارد ادرار مي‌ شود . ( 6 )‌
3 ـ 1 فارماكولوژي

مكانيسم دقيق آن شناخته نشده است اما تصور مي‌ شود باعث ريليز دو پامين از انتهاي دو پامينرژيك اعصابي مي‌ شود كه در جسم سياه افراد پاركينسوني باقي مانده اند . ( 7 ) در بيماري انفلوانزا ، آمانتادين از نفوذ ذرات RNA ويروس به سلول مي‌زبان جلوگيري مي‌ كند . همچنين از نسخه برداري ويروس جلوگيري مي‌ نمايد ( 6 )
4 ـ 1 عوارض جانبي

عوارض معمولاً وابسته به دوز هستند و نسبتاً خفيف مي‌ باشند. غلظت هاي پلاسمايي بالا از آمانتادين ( 1 تا 5 ميكروگرم در ميلي ليتر) با پاسخ هاي نورتوكسيك جدي همراه است شامل : تحريك پذيري ، اشكال در تمركز ، سرگيجه ،‌ گيجي ، بي خوابي ، سردرد تغييرات خلق يا واكنش هاي سايكوتيك ، توهمات، هذيان ، تشنج يا كوما و آريتمي‌‌هاي قلبي ( 3 )

اثرات نوروتوكسيك آمانتادين با مصرف همزمان آنتي هيستامين ها ، داروهاي سايكوتروپيك و آنتي كولينرژيك ها مخصوصاً در افراد مسن تر افزايش مي‌ يابد . ( 3 )

ساير عوارض آمانتادين شامل هيپوتانسيون ارتواستاتيك ، ادم محيطي ، آتاكسي ، لتارژي، تهوع و استفراغ ، بي اشتهايي ، خشكي دهان ، يبوست ، راش پوستي ، تاري ديد ، حساسيت به نور ، لكوپني و CHF .
5 ـ 1 تداخل دارويي

ممكن است اثرات آنتي كولينرژيك ها را تشديد كند ( 4 )

داروهايي كه PH ادرار را بالا مي‌ برند ممكن است ترشح آمانتادين در ادرار را كم كنند.(4 )‌
6 ـ 1 شكل دارويي و مورد مصرف

آمانتادين با نام هاي تجاري Mantadix , Antadine , symmetrel , symadine , Virofral در اشكال كپسول 100M و شربت در بازار دارويي دنيا وجود دارد ( 1 و 5 )

آمانتادين يك آگونيست ضعيف دو پامين و داراي خواص آنتي موسكاريني است . همچنين آنتاگونيست رسپتورهاي N ـ متيل ـ D ـ آسپارتات مي‌ باشد . آمانتادين داراي خواص آنتي پاركينسوني است و در درمان مخصوصاً در مراحل اوليه بيماري بكار مي‌ رود . در بهبود علائمي‌ مانند برادي كينزي ـ سفتي و لرزش مفيد است . اما ممكن است كم كم نسبت به آن مقاومت ايجاد شود ( 4)

در درمان پاركينسون معمولاً با دوز mg100 در روز شروع مي‌ شود و تا دوز 100 mg دوبار در روز افزايش مي‌ يابد . گاهي هم تا دوز mg 400 در روز استفاده مي‌ شود . اما اين دوز نبايد بيشتر شود . ( 4 )

در افراد بالاي 65 سال به دليل كاهش كليرانس كليوي در اين گروه سني بايد حداقل دوز موثر استفاده شود . ( 4 )‌
1 ـ 3 ـ 2 گاز حامل

يك استوانه گاز با فشار زياد به عنوان منبع گاز حامل به كار برده مي‌ شود . در كار با GC در دماي ثابت ، نفوذ پذيري ستون در طول مدت تجزيه تغيير نمي‌ كند . براي آنكه فشار يكنواختي به ابتداي ستوان وارد شود و در نتيجه سرعت جريان گاز ثابت بماند ، بايد از يك تنظيم كننده فشار استفاده شود . در يك دماي معين اين سرعت جريان ثابت گاز ، اجزاي موجود در نمونه را در مدت معيني ( زمان بازداري ) از ستون مي‌‌شويد.(11)

گازهايي كه معمولاً مورد استفاده قرار مي‌ گيرند عبارتند از هيدروژن ، هليم و نيتروژن .

گاز حامل بايد داراي خصوصيات زير باشد :

1 ـ بي اثر باشد تا از هر گونه تأثير بر نمونه يا حلال اجتناب شود .

2 ـ قادر باشد كه نفوذ گاز را به كمترين مقدار برساند .

3 ـ به طور خالص و همي‌شه در دسترس باشد .

4 ـ ارزان باشد .

5 ـ براي آشكار ساز مورد نظر مناسب باشد . (‌11 )
2 ـ 3 ـ 2 محل تزريق نمونه

نمونه از طريق محل تزريق ( inyector ) وارد گاز كروماتوگرافي مي‌ شود . اين محل محفظه اي كوچك است كه يك طرف آن بوسيلة پرده اي ( Septun ) لاستيكي يا سيليكوني پوشيده شده است . نمونه هاي مايع بوسيله يك ريز سرنگ مدرج كه ظرفيت آن چند ميكروليتر است از طريق پرده لاستيكي به داخل محفظه تزريق مي‌ شوند . سرنگ محتوي نمونه ، پرده را سوراخ كرده وارد محفظه مي‌ شود و پس از انجام تزريق و خروج سوزن ، پرده به حالت اول باز مي‌ گردد و سوراخي روي آن باقي نمي‌ ماند . درماي محفظه ورودي نمونه معمولاً 50 بيشتر از نقطة جوش كم فرارترين جزء سازندة‌ نمونه است و بنابراين تبخير آني صورت مي‌ گيرد . ( 11 و 10 )

براي جلوگيري از پهن شدن نوار ، نمونه بايد كوچك باشد و به سرعت و به صورت يك « توپي » بخار وارد ستون شود . ( 11 و 10 )

براي ستونهاي تجزيه اي معمولي ، اندازه نمونه از چند دهم يك ميكروليتر تا 20 تغيير مي‌ كند .

در مورد ستونهاي مويين چون قطر ستون بسيار كم است بايد از مقادير بسيار كم نمونه استفاده شود تاپيكهاي تيز بدست آيد براي اين منظور يك شكافنده نمونه بكار گرفته مي‌‌شود تا تنها كسر كوچكي از نمونه تزريق شده را به سر ستون حمل كند (10) اين روش را Head – space آناليز گويند.
3 ـ 3 ـ 2 ستون ها

جداسازي اجزاي نمونه در داخل ستون هايي كه از فاز ساكن پر شده اند انجام مي‌ شود چنانچه فاز ساكن جامد باشد آن را كروماتوگرافي گاز ـ جامد ( G S C ) مي‌ نامند و اگر فاز ساكن مايع باشد آن را كروماتوگرافي گاز ـ مايع ( G L C ) مي‌ نامي‌م . مايع فاز ساكن به صورت لايه نازكي بر روي جسم جامد بي اثري پخش مي‌ شود . ( 11 )

براي اينكه مواد موجود در ستون ، به طور يكنواخت پر شود ستون مستقيم را ابتدا پر مي‌ كنند و براي اينكه درآون قرار گيرند به صورت مارپيچ در مي‌ آورند .

ستون ها به دو دسته تقسيم مي‌ شوند .
الف ـ ستون هاي پر شده ( Packed Columu ) :

ستونهاي پر شده امروزي از لوله هاي شيشه اي ، فلزي ( فولاد زنگ نزن ، مس، آلومينيم )‌يا تفلون ساخته مي‌ شوند كه نوعاً طول 2 تا 3 متر و قطر داخلي mm 4 ـ 2 دارند ( 10 ) .

قطر خارجي ستونهاي تجزيه اي استاندارد اينچ است . (‌11 )

براي پركردن ستون ، ، ابتدا بايد فاز ساكن را كه يك مايع غليظ است به صورت لايه اي روي يك جسم جامد بي اثر به نام جامد نگهدارنده كشيد . برخي از خصوصيات يك جامد نگهدارنده خوب عبارتند از :

1 ـ بي اثر بودن ( جذب سطحي بر روي آن انجام نشود . )

2 ـ مقاوم در برابر خرد شدن

3 ـ مساحت سطح زياد

4 ـ شكل منظم و اندازة يكنواخت ( 11 )

مادة ‌خام اكثر تركيباتي كه به عنوان نگهدارنده جامد در كروماتوگرافي گازي مورد استفاده قرار مي‌ گيرند دياتومه است . خاك دياتومه سيليكاي هيدراته طبيعي است كه اسكلت دياتومه ها را تشكيل مي‌ دهد . سيليكاي طبيعي داراي تعداد زيادي گروههاي OH است كه مي‌ تواند باعث جذب سطحي فيزيكي گونه هاي آناليت قطبش پذير يا قطبي مانند الكل ها يا هيدوركربنهاي آروماتيك روي سطوح تكيه گاه شود . اين جذب سطحي منجر به پهن شدن و اغلب دنباله دارد شدن پيكها مي‌ شود . براي رفع اين مشكل مواد تكيه گاه مي‌ توانند توسط سيلان دارد شدن با دي متيل كلرو سيلان ( DMCS ) غير فعال شوند .


7 ـ 1 ـ 3 الكتروشيمي‌

اكسيداسيون آمانتادين در تري فلوئرواستيك اسيد موجهاي آنديك متعددي مي‌ دهد . اطلاعات ولتامتري عبارتند از : و (13)

همچنين براي تعيين مقدار آمانتادين از روشهاي كولومتري نيز استفاده شده است . ( 13)
8 ـ 1 ـ 3 فلورسانس اسپكترومتري

واكنش با Fluores camine در غلظت 1 ميكرومول ، بعد از استخراج در 5 = pH با اتيل استات محصولي با ماكزيممي‌ در 475/ 395 نانومتر مي‌ دهد .

حد قابل تشخيص 1 ميكروگرم در ميلي ليتر است . ( 13 )
2 ـ 3 بازنگري مقالات آناليز پلاسمايي آمانتادين هيدروكلرايد

1 ـ در سال 1990، Hiroyuki Fujino و Shujiro GoyaA روشي را براي اندازه گيري آمانتادين به وسيله دستگاه HPLC ارائه دادند . در اين روش آمانتادين به وسيله واكنشگر3 – ( 4,6- Difluorotriazinyl ) amino-7-methoxy coumarin در بنزن در دماي 140 به مدت 5 دقيقه به مشتق فلورسانس دارد تبديل شد . و به وسيله دتكتور فلورسانس تعيين مقدار شد . حد تشخيص در اين روش fmal250 در 100 ميكروليتر ادرار بود . ( 14 )‌

2 ـ در سال 1990 DAVID C . LOCKE , JOHN , T . SCHMERMUND روشي را براي اندازه گيري آمانتادين با دتكتور فوتويونيزان ( photoionization ) دستگاه HPLC ارائه دادند . در اين مطالعه از سيستم فاز معكوس و فاز متحرك آب ـ متانول ـ تري اتيل آمين ارتوفسفريك اسيد استفاده شد . – حد تشخيص 25ng در هر تزريق بود.( 15 )

3 ـ در سال 1990 J.TEEUWSEN , F.A.L VAN DERHORST و همكاران روشي را براي اندازه گيري آمانتادين در ادرار با استفاده از روش HPLC ارائه كردند . در اين روش ميسل هاي كاتيوني براي مشتق سازي آمانتادين با كروموفور1-fluoro-2,4-dinitrobenzene در ادرار استفاده شد . در حضور mM90 ستيل تري متيل آمونيوم برومايد واكنش تبديل آمانتادين به مشتق آن در مدت 4 دقيقه در دماي 60 و 1 = pH كامل شد . از سيستم فاز معكوس HPLC استفاده شد و حد تشخيص در اين روش 75 بود . ( 16 )

4 ـ در سال 1993 Ira S.Krull , Feng-Xiang Zhou در آمريكا روشي را براي اندازه گيري آمانتادين در پلاسما و ادرار بوسيله automated solid phase derivatization ارائه كردند . در اين روش مشتق سازي و استخراج همزمان مايعات بيولوژيك بوسيله 9-Fluoreneacetate واكنشگرمشتق ساز فاز جامد انجام شد.

مشتق آمانتادين در سيستم فاز معكوس جداسازي و بوسيله دتكتور فلورسانس اندازه گيري شد . حساسيت روش آنها براي اندازه گيري آمانتادين در ادرار و پلاسما 74/0 و 79/0 نانوگرم بود . ( حجم تزريق 50 ميكروليتر ) ( 17 )

5 ـ در سال 1980 Noall MW , Stumph mj و Knight V. روشي را براي اندازه گيري آمانتادين در ادرار به وسيله دستگاه گاز كروماتوگراف ارائه دادند . در اين روش از بتا ـ فنيل اتيل آمين به عنوان استاندارد استفاده شد . نمونه هاي ادراري قليايي شده و با 5/0 ميلي ليتر كلروفرم استخراج شدند . فاز آلي جدا شده و مستقيماً به دستگاه گاز كروماتوگرافي تزريق شدند . پاسخ خطي در محدوده 2 تا 125 ميلي گرم در ميلي ليتر مشاهده شد . حد قابل تشخيص 5/0 بود . ( 18 )

در اين مطالعه حساسيت روش بسيار پائين است و در واقع براي اندازه گيري آمانتادين در پلاسما حساسيت ندارد . از طرفي در اين روش از 2 ـ فنيل اتيل آمين به عنوان استاندارد داخلي استفاده شده است كه يك ماده اندوژن مي‌ باشد و در ادرار به مقدار قابل توجه ترشح مي‌ شود .
2 ـ 3 ـ 3 ـ انتخاب استاندارد داخلي

سيكلوهگزيل آمين ، نقتيل آمين ، ايمي‌ پرامين و پسودوافدرين آزمايش شدند كه با توجه به زمان بازداري و عدم تداخل با مواد آندوژن پسودوافدرين به عنوان مناسب ترين استاندارد داخلي انتخاب گشت.
3 – 3 ـ 3 ـ حلال استخراجي

حلالهاي كلروفرم ، هگزان و دي اتيل اتر مورد بررسي قرار گرفتند . كه با توجه به ميزان بازيافت و نيز انتخاب پذيري بهترين نتايج با دي اتيل اتر بدست آمد .
4 ـ 3 ـ 3 ـ آماده سازي نمونه هاي سرمي‌

1-4-3-3- خصوصيات خون و انواع روشهاي استخراج

با توجه به اهميت بسيار بالاي استخراج دارو از مايعات زيستي (خون، پلاسما يا سرم و ادرار) ، لذا ابتدا مختصري راجع به اين مايع زيستي (خون) و انواع روشهاي استخراج توضيح داده مي شود و يك مقايسه نسبي نيز بين اين روشها و مزايا و معايب آنها نسبت به هم ارائه مي گردد.

خون پيچيده ترين مايع زيستي است كه پس از دريافت از انسان و يا حيوان به صورت مايعي شفاف و بافر شده محتوي پروتئين هاي محلول، چربيها و نمك هاي محلول در آب و سلول هاي معلق مي باشد. خوشبختانه جزء اصلي خون يعني گلبولهاي قرمز يا ارپترويست ها به سادگي از محلول شفاف يا پلاسما توسط سانتريفوژ كردن قابل جداسازي است، معهذا در صورت عدم دقت در عملكرد با خون سلولها مي توانند شكسته شده و روش عملي جداسازي بسيار پيچيده گردد.

به طور كلي هيچگاه خون به طور مستقيم استخراج نشده، بلكه ابتدا هميشه سرم يا پلاسما تهيه و سپس بقيه عمليات بر روي آنها صورت مي پذيرد، در صورتيكه مستقيم از خون صورت پذيرد بايد تدابير لازم جهت اجتناب از پارگي سلولهاي قرمز اتخاذ گردد.