مقاله بررسي نحوه توليد و سم‌زدايي آفلاتركيسن

مقاله بررسي نحوه توليد و سم‌زدايي آفلاتركيسن در 40 صفحه ورد قابل ويرايش
مقدمه

آفلاتوكسين‌ها گروهي از مايكوتوكسين‌ها با قدرت سرطان‌زايي، جهش‌زايي و كاهش كارآيي سيستم ايمني، مي‌باشند (Eatan &Gallagher , 1294; IARC , 1993) آنها از متابوليت‌هاي ثانويه سنتز شده توسط سويه هاي سم‌زاي ASpergillus flavus , Aspergillus parasiticvs و Aspergillus nomius مي‌باشند. آفلاتوكسين B1 با توجه به پتانسيل بالاتري كه دارد، بيشتر مورد توجه قرار دارد. رشد قارچهاي مولد سم وآلوده شدن به آفلاتوكسين در بسياري از محصولات غذايي ديده مي‌شود (Wood , 1989). در صورت مصرف غذاهاي آلوده به سموم آفلاتوكسين B1­ و B2، اين سموم به‌آفلاتوكسين‌هاي M1 و M2 متابوليزه مي‌شوند و به درون بافت‌هاومايعات بيولوژيكي و شير حيوانات شيرده ترشح مي‌شوند (Zarba etal , 1992).

سويه‌هاي گونه‌هاي Bifidiobacterium , Lactobacillus , Lactococcus در توليد محصولات شيري تخميري به عنوان استارتر كالچر و توليد كننده طعم و بو، به كار مي‌روند نقش اصلي اين كشت‌ها توليد اسيدهاي آلي مثل اسيدلاكتيك در طي مراحل تخمير است كه سبب افزايش عمر قفسه‌اي محصولات مي‌شود و هم محتويات حساس آنها را تغيير مي‌دهد.

اگر شير به آفلاتوكسين‌ آلوده باشد، احتمال تخريب مرحله تخمير و توليد تركيباتي با بوي تغيير يافته و ناخواسته را در محصول ايجاد مي‌كند (Sutic & Banina , 1990).

اخيراً EL – Nezami و همكارانش (1996 , 1998) گزارشاتي ارائه داده‌اند مبني بر وجود سويه‌هاي خاص لاكتوباسيل‌ كه توانسته‌اند آفلاتوكسين‌ها را از محلول آبي جداكنند. به علاوه سويه‌هاي خاصي از باكتري‌هاي اسيد لاكتيك، توانسته‌اند آفلاتوكسين M1 را از شير آلوده هم جداكنند (Pierides etal . ;2000). جداسازي آفلاتوكسين در نتيجه اتصال فيزيكي سم به ديواره سلولي يا تركيبات ديواره سلولي است (Haskard et al. 2000 ; EL- Nezami et al. 1998 b).

همچنين جداسازي بعضي متابوليت‌هاي ضدقارچي مثل دي‌پپتيهدهاي حلقوي و فنيل‌لاكتيك اسيد و اسيدهاي چرب هيدوركسيله شده از باكتري‌هاي اسيدلاكتيك، توانايي اين گونه‌ها در بازدارندگي رشد قارچ‌هاي فاسد كننده مواد غذايي و مواد سم‌آفلاتوكسين را نشان مي‌دهد.
آفلاتوكسين در ذرت

متابوليتهاي سمي توليد شده توسط قارچها، كه به عنوان مايكوتوكسين شناخته مي‌شوند، در طي چند سال اخير بسيار مورد توجه واقع شده‌اند. مايكوتوكسين‌ها امروزه به عنوان تهديد كننده‌هاي سلامتي در حيوانات شناخته شده‌اند كه بيماري‌هايي مثل equine leukoencephalo malaci در اسب‌ها و Porcine edema را در خوك‌ها ايجاد مي‌كنند. كاهش وزن، كاهش باروري و كاهش مقاومت در برابر بيماريها و حتي مرگ را به مايكوتوكسين نسبت داده‌اند. هيچ حيواني نسبت به آنها مقاوم نيست ولي به طور كلي حيوانات پيرتر مقاوم‌تر از حيوانات جوان هستند. بعضي مايكوتوكسين‌ها، مثل آفلاتوكسين در سلامتي‌اشان هم مخاطراتي را ايجاد مي‌كنند. اين مايكوتوكسين به عنوان يك موتاژن شناخته شده است. شناسايي آفلاتوكسين در ذرت مي‌تواند باعث كاهش قيمت آن جهت بذر و يا حتي معدوم ساختن آن شود. آلودگي با مايكوتوكسين ها ارتباط مستقيم با تاثيرات جوي دارد.

قارچ Aspergillus Flavus توليد كننده آفلاتوكسين در محصولاتي مثل ذرت، پنبه‌دانه و بادام زميني است. قارچ به طور معمول در طبيعت وجود دارد، اما مقدار آن در هواي گرم و خشك افزايش مي‌يابد. آلودگي آفلاتوكسين در ذرت‌هايي بيشتر است كه تحت شرايط استرس توليد شده‌اند. بنابراين، خشكي، گرما، حشرات، كرم‌ها و استرس‌ ناشي از باروركنندگي همگي منجر به ايجاد مقادير بالاي آفلاتوكسين در گياه مي‌شوند. تلاش براي ايجاد هيبريدهاي ذرتي كه به آلودگي قارچي مقاوم باشند و سم را در خود انباشته نكنند، وجود دارد، با وجود اين هيبريدها بسيار مقاوم هستند ولي از تجمع سم به طور كلي نمي توان جلوگيري كرد. با كاهش استرس و مراقبت از حمله حشرات مي‌توان در مقدار آفلاتوكسين كاهش ايجاد كرد (CAST , 1999) .

دماي Fْ100-80 و رطوبت نسبي %85 (% 20-18 رطوبت در دانه‌ها وجود دارد) شرايطي بهينه براي توليد سم و رشد قارچ است.

از طرف ديگر مصرف‌ اين محصولات به عنوان خوراك دام مي‌تواند سبب ايجاد انواع ديگري از آفلاتوكسين‌ها (M1 , M­2) در شير حيوانات شود. آلودگي ذرت به عنوان غذاي دام و طيور و نيز ماده اوليه جهت فراهم كردن انواع گسترده‌اي از مواد غذايي و تنقلات، داراي اهميت ويژه‌اي است و كاهش آفلاتوكسين به روشهاي مختلف ضروري مي‌باشد.

محصولات كشاورزي مثل ذرت، علوفه، بنشن، گندم و يونجه را مي‌توان با سيلوكردن نگاهداري كرد. در بسياري از كشورها محصولات سيلويي داراي ارزش غذايي بالاتري به خصوص براي دام‌ها مي‌باشند. در كشورهاي اروپايي مثل هلند، آلمان و دانمارك بيش از %90 محصولات توليدي در سيلوها نگاهداري مي‌شوند. حتي در كشورهايي با شرايط عمومي آب وهوايي مناسب جهت خشك كردن مثل فرانسه و ايتاليا، حدود %50 از محصولات خود را در سيلوها نگاهداري مي كنند. (wilkson et al.1996) . جهت توليد سيلويي با كيفيت بالا نياز به مراحل تخمير ميكروبي مناسب وجود دارد. ميكروارگانيسم‌هاي دخيل در مراحل تخمير سيلوها، علاوه بر افزايش كيفيت غذايي محصول، قادر خواهند بود تا از رشد ميكروارگانيسم‌هاي بيماري‌زا و همچنين قارچ‌هاي مولد توكسين، جلوگيري كنند.

از آنجاييكه سيلوكردن محصولات بر پايه تخميرهاي متنوع اسيد لاكتيكي تحت شرايط بي‌هوازي است، به كار بردن سويه‌هاي باكتريايي توليدكننده اسيدلاكتيك كه در سم‌زدايي و كاهش توليد آفلاتوكسين مؤثر هستند، منطقي‌تر به نظر مي‌رسد. باكتري‌هاي اسيدلاكتيك محيطي و ساپروفيت موجود در محصولات، كربوهيدارتهاي محلول در آب (WSC) موجود در محصولات را به اسيدلاكتيك و نيز مقدار كمي اسيداستيك تخمير مي‌كنند. بر اثر توليد اين اسيدها، PH مواد سيلو شده پايين آمده و رشد ميكروارگانيسم‌هاي فاسدكننده، باز داشته مي‌شود. باكتري‌هاي اسيدلاكتيكي كه عمدتاً در سيلوها يافت مي‌شوند. اعضاي جنسي‌هاي لاكتوبا سيلوس، پديوكوكوس، لوكونوستوك، انتروكوكوس، لاكتوكوكوس و استرپتوكوكوس مي‌باشند. اكثر باكتري‌هاي اسيدلاكتيك موجود در سيلوها، مزوفيل‌اند، يعني در دماي بين Cْ50-5 رشد مي‌كنند كه دماي بهينه رشد آنها بين Cْ40-25 مي‌باشد. آنها PH سيلو را تا 5-4 پايين مي‌آورند كه اين به گونه و شرايط محصول بستگي دارد.

همه باكتري‌هاي اسيدلاكتيكي هوازي هاي اختياري‌ اند اما بعضي شرايط بي‌هوازي را ترجيح مي‌دهند (Holzapfel and schillinger , 1992; Teuber et al. 1992) . جمعيت LAB در فاصله بين دروكردن و سيلو كردن محصول افزايش مي‌يابد، كه اين بر اثر احياء حالت‌هاي تاخيري است و نه اضافه كردن مصنوعي و تلقيح ميكروارگانيسم. محتواي قندي و تركيبات قندي موجود در محصول و مقدار ماده خشك و شرايط اسيدي و اسمزي موجود در سيلو، بر رشد و رقابت باكتري‌هاي اسيد لاكتيك در تخمير سيلويي تأثير مي‌گذارند. فاز تخميري سيلوها در زمانيكه شرايط سيلو بي‌هوازي شود، آغاز مي شود كه اين عمل معمولاً بعد از چند ساعت از سيلوكردن كه اكسيژن اتمسفري موجود در اعضاي گياه و فواصل محصول خارج شد، آغاز مي‌شود و بسته به نوع محصول سيلو شده و شرايط سيلو، براي چند روز تا چند هفته ادامه پيدا مي‌كند. در اين فاز، لاكتو باسيل‌ها ميكروارگانيسم‌هاي غالب سيلو هستند و PH سيلو را با توجه به عمل تخمير خود بين 5-8/3 پايين مي‌آورند.

در فاز سوم كه فاز ثابت مي‌باشد كه در صورت عدم دخول هوا به داخل سيلو، در بعضي مواقع به وجود مي‌آيد. در اين حالت اكثر ميكروارگانيسم‌هاي فاز تخميري كاهش پيدا مي‌كنند و تنها بعضي باكتري‌هاي مقاوم به اسيد كه قادر به توليد پروتئازها و كربوهيدراتازهاي مقاوم به اسيد هستند، مثل lactobacillus buchneri در مقادير كم قادر به رشد خواهند بود.

در فاز چهارم كه به محض قرار گرفتن سيلو در برابر هوا آغاز مي‌شود، اسيد آلي نگاهدارنده توليد شده توسط مخمرها و گاهي نيز باكتري‌هاي اسيد استيك تخريب مي‌شوند و درنتيجه PH بالا مي‌رود و در مرحله بعد ميكروارگانيسم‌هاي فاسد كننده شروع به فعاليت مي‌كنند و قارچ‌هاي توليدكننده توكسين‌ مثل آسپرژيلوس فلاووس در اين مرحله شروع به رشد و توليد سم مي‌كنند (Nout et al, 1993) .

به نظر مي‌رسد كه نگاهداري سيلو در فازهاي 2 و 3 با استفاده از افزودنيها و كاهش اكسيژن در هنگام سيلوكردن محصول، باعث جلوگيري از فساد قارچي و توليد سم خواهد شد.(Ste Fanie J. W. H. Oude Elferin Ketae. 2000) .

خصوصيات بيولوژيكي و مورفولوژيكي Aspergillus Flavus

آسپرژيلوس فلاووس متعلق به جنس آسپرژيلوس است كه دومين گونه متداول بعد از آسپرژيلوس فوميگاتوس مي‌باشد. كلني‌هاي A. flavus سريع رشد مي‌كنند و قطر كلني آنها به cm 7-6 در 14-10 روز مي‌رسد. رنگ كلني در ابتدا زرد است و سپس به زرد متمايل به سبز يا سبز زيتوني تبديل مي‌شود. كلني‌هاي قديمي سبز تيره مي‌شوند. شكل كلني‌ها صاف است و بعضي داراي چروك‌هاي شعاعي‌اند. پشت كلني بدون رنگ و يا به رنگ كرم است. محيط افتراقي، A. flavus , parasiticus آگار (AFPB) است كه براي غربالگري و شناسايي گونه‌هاي A. flavus طراحي شده است. I- Pitt , A.D.Hocking , 1985; H.Govrama , L.B.Bullerman ,1995 A.parasiticus , A. Flavas در اين محيط با توليد اسپورهاي تيپيك زرد تا سبز زيتوني و پشت كلني نارنجي روشن، متمايز مي‌شوند. (K. B. Raper, (D.I.Fennell,1965) . جزئيات بيشتر را مي توان زير ميكروسكوپ الكتروني اسكنينك (SEM) ديد: كنيديوسپورها بلند هستند ( 800 -400) و اغلب ظاهري سخت درست در كنار وزيكول‌هاي كروي دارد (253-24). فيلايدها به شكل پيراموني بلند شده‌اند و در دو رديف قرار دارند و بعضي اوقات تك رديفي هستند؛ شكل سرهاي كنيديال از ستوني تا شعاعي و كروي متغير است؛ طرز قرارگيري فيلايدها بر روي وزيكول شكل سركنيديال را تعيين مي‌كند. قطر آنها بين 65 -10 متغير است (J.I.PiH & A.D.Hocking 1985) كنيدي‌ها از جدايي‌هاي A. flavus صاف تا كمي خشن هستند، در حاليكه كنيدي‌ها از A. Parasiticus خشن هستند. گونه‌هاي خاصي توليد اسكلروتياي قهوه‌اي مي‌كنند.

گونه‌هاي آسپرژيلوس فلاووس در خاك وجود دارند و طيف وسيعي از محصولات كشاورزي را در مزرعه‌ محل‌هاي نگهداري و نيز در طي فرآوري‌ و توزيع آلوده مي‌كنند. Aspergillus Flavus زيرگونه A. bombycis , A.tamarii, A. nomius, Parasiticus تنها قارچهايي هستند كه توليد آفلاتوكسين در آنها نشان داده شده است (C. P.Kurtmon, 1987 S. W. peterson, Y.Ito, B.W.Horn, T.Go to 2001; C.W.Hesseltin, B.W.Horn ).

سويه هاي آسپرژيلوس فلاووس داراي انواع غيرسم‌زا و توليد كننده‌هاي آفلاتوكسين (B1 , B2, ) مي‌باشد كه در اين بين A. Flavus زيرگونه پارازيتيكوس، آفلاتوكسين‌هاي B1, B2, G1, G­2. (AFG2, AFG1,AFB1, AFB2 ) را توليد مي‌كند و جدايي‌هاي غيرسم‌زايي كه آفلاتوكسين توليد نمي‌كنند در طبيعت نادر است (Du sanee Thanaboripat, Yang Qian, Lliu Ruigian, 2001)
توليد آفلاتوكسين

تخمين غلظت باكتريايي.

جهت تعيين مقدار مشخصي از باكتري مورد نظر، ازمقايسه نمونه ها با شاهد مك فارلند استفاده كرديم. براي به دست آوردن تعداد تقريبي 109*9 باكتري درهر ميلي ليتر، درهرلوله 3ml ازمحيط كشت مايع MRS را ريختيم تا كدورتي مشابه كدورت مك فارلند 10 پيدا كند(جذب نمونه ها در 600nm خوانده شده) بعد از تطبيق OD نمونه ها با شاهد مك فارلند، نمونه ها سانتريفوژ شده ، محيط كشت MRS دورريخته شد و حدود 3ml محلول فسفات با فرسالين (PBS) با PH 7/23 ريخته شد و بعد از يكنواخت كردن سوسپانسيون باكتري در PBS مجدداً عمل سانتريفوژ (به مدت 12min بادور 2500-3000 rpm) صورت گرفت و مايع رويي دورريخته شد. اين مرحله رادوبار تكرار كرديم و بدين ترتيب هيچ محيط كشتي درسوسپانسيون باكتريايي باقي نماند و رسوب باكتريايي كه درانتها به دست آمد را براي اضافه كردن محلول آفلاتوكسين كنار ميگذاريم (k.peltonen,w.El.nezami,2001).
تعيين منحني رشد باكتري

دراين مرحله به دليل مقايسه جذب آفلاتوكسين توسط لاكتوباسيلوس درفازهاي رشد و سكون و مرگ، منحني رشد باكتري را تعيين كرديم. بدين منظور، ازسوسپانسيون باكتريايي را به محيط كشت MRS مايع تلقيح كرديم و درفواصل زماني 2h مقدارOO را درطول موج 600 nm خوانديم . درنهايت منحني رشد باكتري را براساس مقدار جذب به زمان رسم كرديم و مراحل فاز رشد و سكون تعيين شد.

براي بررسي مقدار كاهش آفلاتوكسين درحالت مرگ باكتري، سوسپانسيون باكتري مقايسه شده با 10 مك فارلند را اتوكلاو كرديم، تا باكتري ها كاملاً ازبين بروند، سپس سانتريوفوژ كرده و به رسوب باكتريايي محلول آفلاتوكسين اضافه كرديم.

همچنين جهت بررسي ميزان رشد يا عدم رشد سويه باكتري بهينه درمحلول آفلاتوكسين مورد آزمايش و نيز PBS به تنهايي، درطول مدت 120h مقدار جذب محلول رادرطول موج 600 nm خوانديم و روند رشد باكتري رادراين محلول ها بررسي كرديم.
تعيين ميزان كاهش آفلاتوكسين

(Sigma,st.louis,Mo.)AFB1 درمتانول حل شد و غلظت آن را با خواندن جذب آن به وسيله اسپكتروفوتومتري (unicam 5625 uv/vis) درطول موج 365 nm (4 = 21500 M-1cm-1) و نيز معادله lamber-beer به دست آورديم وبراي تهيه 25ml محلول آفلاتوكسين 5ppm، 11/3 ml ازمحلول را در evaporator گذاشتيم و متانول آن را تبخير كرديم و سپس به وسيله PBS به حجم رسانديم و بدين ترتيب، محلول آفلاتوكسين باغلظت (gr/ml) 5ppmبه دست آورديم. از اين محلول 5ppm ، محلولهاي ديگري با غلظت هاي 1000ppb (ngr/ml)و500و400و200و100و50 جهت مقايسه اثر كاهش درغلظتهاي مختلف ونيز كالبراسيون دستگاه HPLC تهيه كرديم.

؟

به رسوبات باكتري تهيه شده درمرحله قبل، 1/5 ml ازمحلول آفلاتوكسppm)B1 5/0)اضافه كرديم و درمدت زمانهاي مختلف دردماي Cْ37 گرماگذاري كرديم. براي هر سويه باكتريايي، يك شاهد باكتريايي (باكتري تلقيح شده در PBS) و يك شاهد AFB1 (5/0 آفلاتوكسين B1 در PBS) گذاشتيم (k.peltanen,H.EL.Nezamie,2001)

درهر مرحله زماني، جهت بررسي مقدار AFB1 كاهش نيافته، بعد از سانتريوفوژ كردن محلول ها و رسوب دادن باكتريها 100 ,(2500-3000 rpm,12min) از فاز مايع راجهت بررسي برمي داريم. زمان گرماگذاري تا 90 h ادامه يافت و درمقاطع زماني 1,24,48,90 h ازمايع رويي محلول باكتري و AFB1 برداشت شد. كليه بررسي‌ها سه تكرار داشتند.
اثر شستشو بربازگشت آفلاتوكسين كاهش يافته

بعد از اتمام دوره گرماگذاري و برداشتن 100 مايع رويي محلول درمقاطع زماني مختلف، درانتهاي 90h، مايع رويي دور ريخته شده و رسوب باكتريايي به وسيله 2ml محلول PBS شسته مي شود. بدين صورت كه بعد از اضافه كردن PBS و يكنواخت كردن سوسپانسيون، آن را به مدت 10min دردماي Cْ37 گرماگذاري كرديم و سپس مجدداً سوسپانسيون را سانتريوفوژ كرديم و 100 ازمايع رويي را براي سنجش ميزان آفلاتوكسين آزاد شده بررسي كرديم. اين عمل را سه بار تكرار كرديم و بعد از هر بار شستشو مقدار آفلاتوكسين آزاد شده را بررسي كرديم.

(Carolyn A.Haskard et al,2001;K.Peltonen,W.EI.Nezami,2001)

تعيين مقدار AEB1 باقي مانده درمايع رويي نمونه ها

مايع رويي نمونه ها به وسيله دستگاه HPLC براي تعيين ميزان AFB1 كاهش يافته توسط باكتري مورد نظر با استفاده از اين فرمول محاسبه شد(K.Peltonen et al,2001)

؟

ازاين شاهد AFB1 براي تعيين ميزان AFB1 آزاد شده پس از شستشو هم استفاده شد.
HPLC

جهت تعيين ميزان آفلاتوكسين از روش HPLC فاز معكوس بدون روش استخراج، استفاده شد (EL-Nezami et al,1998a). سيستم HPL3 (Cat No.CTS-03525) (Serial.No.880-06, Lot.No.26/275 شامل يك سيستم انتقال دهنده فاز سيال دو پمپي ، دتكتور UV و يك ستون ODS spheri-5 C18 با ابعاد 2504/6mm بود. حجم نمونه تزريقي معادل 70 بودوفاز سيال عبارت بود از :آب مقطر/متانول/استونيتريل ;vol/vol/vol) 58/21/21)كه داراي Flow rate ياسرعت جريان 1/25ml/min بود. طول موج دتكتور UV برروي 365nm تنظيم شده بود.

ابتدا به وسيله هفت محلول استاندارد آفلاتوكسين B1 تهيه شده درمراحل قبل ، منحني كاليبراسيون دستگاه تهيه شد .

(Kalantri, H, zandamoghadam A,Ahvaz-Iran;A.manda,B.P.Naidu,Nageswara Rao C.2004)
سويه هاي قارچي و شرايط كشت

جدايي آسپرژيلوس فلاووس توكسين‌زا (MAS 915 ;473.5 ppb) ازموسسه دفع آفات و بيماريهاي گياهي، بخش مايكوتوكسين، تهيه شد. يك كشت Slant ازآن تهيه شد(برروي Potato Dextrose Agav,PDA) به مدت يك هفته دردماي Cْ30 نگهداري شد. براي شمارش تعداد اسپورها، PBS 5ml به درون لوله ريخته شد و بعد ازشستشوي كامل، سوسپانسيون حاوي اسپورهاي قارچي به لوله استريلي كه حاوي 50 توئين 80 استريل شده بود، انتقال داده شد. سپس 50 از سوسپانسيون حاصل را برروي لام نئو بارگذاشتيم و تعداد اسپورها راشمارش كرديم. كل تعداد اسپورها را به 400تقسيم كرديم تا دراين صورت مقدار اسپور موجود درهر مربع كوچك را بيابيم، سپس از آنجاييكه اين تعداد درحجم 1/4000,000ml هر مربع مي باشد بايد رقم حاصل رادر 4000,000 ضرب بكنيم و بدين گونه، تعداد اسپورها را هرميلي ليتر محاسبه كرديم. جهت تهيه 103 و 106اسپور، رقتهاي متوالي تهيه كرديم، تا به تعداد مورد نظر برسيم.

(jesper magnusson, Johan schnurer, 2000, katrin strom, Jorgen sjogren, 2002)