مقاله بررسي ميزان آدنوزين تري فسفات در اسپرم مولدين ماهي كفال در شرايط مختلف

مقاله بررسي ميزان آدنوزين تري فسفات در اسپرم مولدين ماهي كفال در شرايط مختلف در 22 صفحه ورد قابل ويرايش

چکيده:

کفال ماهيان درياي خزر يکي از مهمترين ماهيان شيلا تي اين دريا مي باشند که امروزه اکثريت صيد ماهيان درياي مذکور به خود اختصاص داده اند.: هدف از اين تحقيق بررسي ميزان ATP اسپرم ماهي کفال طلايي[1] در شرايط زماني، دمايي و تداوم بخش[2]هاي مختلف بوده است.: بدين منظور ميزان ATP اسپرم هاي:

1) نمونه هاي تازه در دماهاي مختلف 10-12 درجه و 18-20 درجه سانتي گراد،

2) نمونه هاي نگهداري شده در دماهاي مختلف4 (درجه و دماي اتاق) به مدت شش ساعت،

3) نمونه هاي نگهداري شده در ( تداوم بخش هاي مختلف ( گليسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک 65/0%) به مدت 5 و 10 روز، به روش فوق حساس بيو- لومينوسانس اندازه گيري گرديد.

بر اساس آزمايش هاي انجام شده در اين تحقيق غلظت ATP اسپرم هاي تازه نمونه گيري شده در دماي 10 تا 12 درجه سانتيگراد 22/7 ±04/74% غلظت ATP اسپرم هاي تازه نمونه گيري شده در دماي 18 تا 20 درجه بود. اسپرم هاي نگهداري شده در دماي 4 درجه و دماي آزمايشگاه به مدت 6 ساعت به ترتيب 91/0 ±26/90% و 49/1 ±17/17% ATP خود را حفظ کردند.

نگهداري اسپرم در تداوم بخش هاي مختلف( گليسرول، محلول نمک 7/0 %، محلول نمک 65/0% ) به مدت 5 روز نشان داد که گليسرول و محلول نمک 65/0% درصد بالاتري از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% حفظ کردند و نگهداري اسپرم در همان تداوم بخش ها به مدت 10 روز نشان داد که گليسرول درصد بالاتري از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% و 65/0% حفظ کرد.

براساس نتايج بدست آمده براي حفظ ميزان ATP اسپرم ماهي كفال طلايي نمونه گيري در دماي 18-20 درجه و نگهداري در گليسرول توصيه مي شود.



واژگان کليدي: اسپرم، ماهي کفال طلايي، ATP،




مقدمه:

اسپرم به عنوان يک عامل مهم توليد مثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسي اسپرم از نظر پارامترهايي چون توانايي تلقيح، تحرک، درصد اسپرم هاي متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکي، ميزان ATP و فاکتورهاي شيميايي و بيو شيميايي، در تشخيص کيفيت اسپرم و کنترل روند توليد مثلي موجودات زنده از جمله آبزيان به ما کمک مي کند. به همين علت تاکنون تحقيقات گسترده ايي توسط پژوهشگران مختلف روي اين سلول صورت گرفته است. با اين حال مطالعات انجام شده در ارتباط با ميزان ATP اسپرم ماهيان نسبتا کم است. اين امر تفسير علت ناموفق بودن پروژه هاي پرورشي کردن برخي ماهيان را دشوار مي کند. در اين رابطه بايد مطالعات بيشتري در زمينه بررسي ميزان ATP اسپرم ماهيان صورت پذيرد. اسپرم به کمک حرکت ضربه ايي تاژک خود شنا مي کند. انرژي مورد نياز براي اين حرکت از طريق هيدروليزATP فراهم مي شود.(1).تحرک اسپرم به ميزان ATP ذخيره ايي اوليه(2) و ميزان ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (3) وابسته است. در اکثر ماهياني که داراي لقاح خارجي هستند،ATP سنتاز قادر به نگهداري نسبت هاي بالاي ATP هيدروليز شده مورد نياز در طول حرکت نيست لذا ميزان ATP به سرعت کاهش مي يابد. اين کاهش ATP به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکي و سرعت حرکت اسپرم است(2). يك رابطه خطي بين ظرفيت تلقيح اسپرم و پارامترهاي اسپرمي از جمله ميزان ATP و سرعت حركت اسپرم وجود دارد(4) آنزيم اصلي تبديل انرژي شيميايي گراديان پروتون در سيستم بيولوژيكي ، ATP سنتتاز است. اين آنزيم براي سنتز ATP از ADP و فسفات غيرآلي استفاده مي كند ساختمان و عملكرد اين آنزيم در گونه هاي مختلف يكسان است (5) تفاوت قابل توجهي بين گونه ها در مقدار ATPمورد نياز براي تامين حرکت اسپرم وجود دارد(6). تحقيقي در رابطه با ميزان ATP اسپرم ماهي کفال طلايي تاکنون صورت نگرفته است. در اين پروژه سعي بر آن داشتيم که ميزانATP اسپرم ماهي کفال طلايي را در شرايط مختلف اندازه گيري نماييم.

مواد و روشها:

به منظور بيان ميزان ATP برحسب تعداد سلول ، تعداد اسپرم هاي موجود در يك ميلي ليتر از مايع اسپرم اخذ شده از 10 ماهي نر كفال طلايي ، به كمك لام نئوبار و ميكروسكوپ نوري (NIKON Y100) مورد شمارش قرار گرفت. در اين تحقيق جهت بررسي تاثير دماي نمونه گيري و ميزان ATP اسپرم ماهي ، نمونه گيري در دو دماي ?C 10-12 و18-20 ?C انجام شد . ما در اين تحقيق براي اندازه گيري ميزان ATP از روش بيولومينوسانس استفاده کرديم بدين شکل که نمونه اسپرم را به نسبت 100/1 در محلول بافر HEPES جوشان مخلوط کرده سپس 50 از آن را با 50 از محلول کيت حساس بيولومينو سانس (Biaffin) در پليت مخصوص اندازه گيري لومينوسانس با هم مخلوط کرده و سينگالهاي لومينوسانس را با استفاده از دستگاه لومينومتر
10-19 mol/well, Germany) × (Lumistar ,BMG labtech GmbH, 5اندازه گيري کرده و سپس ميزان ATP هرنمونه را با استفاده از استانداردهاي ATP محاسبه کرده و بصورت nmol/108 اسپرم بيان کرديم.

درجه حرارت نگهداري اسپرم ها بر ميزان ATP سلول هاي مذكور تاثيرگذار خواهد بود. لذا جهت بررسي دماي مناسب نگهداري ، اسپرم ها به مدت 6 ساعت در دماي 4 درجه و دماي آزمايشگاه نگهداري و سپس ميزان ATP آن ها مورد اندازه گيري قرار گرفت. معمولا براي نگهداري اسپرم از محلول هاي تداوم بخشExtenders )) استفاده مي كنند اين محلول ها سبب تداوم و حفظ فعاليت اسپرم ها در دوره نگهداري مي شوند. به منظور بررسي بهترين محلول تداوم بخش ، محلول گليسرول 10 درصد و گلوكز 0.3 مولار ، محلول نمك 0.7 درصد و محلول نمك 0.65 درصد مورد بررسي قرار گرفتند . ميزان ATP اسپرم ها در محلول هاي مذكور پس از نگهداري اسپرم در دماي منفي 15 درجه در زمان هاي 5 و 10 روز مورد سنجش قرار گرفت.

جهت انجام تحقيق در روز دهم آبان 1384از درياچه خزر که دماي آب آن 18 تا 20?C و شوري آن 12 تا 13 ppm بود و همچنين در روز 17 آبان 1384 در پي کولاک و کاهش چشمگيردماي هوا از درياچه خزرکه دماي آب آن 10 تا 12 ?C و شوري آن 12 تا ppm 13

بحث و نتيجه گيري

تحقيقات زيادي در ارتباط با اسپرم ماهي در جهان صورت گرفته است که هر کدام جنبه خاصي را مد نظر قرار داده است. محدوديت ها و مشكلات و عوامل موجب خطا به صورت زير است : يكي از مشكلات و محدوديت هاي اين پروژه، محدوديت زماني بود زيرا اين پروژه بايد در طول فصل توليد مثل ماهي كفال طلايي كه دو ماه مي باشد انجام مي شد هم چنين به علت بروز مشكلات غيرمترقبه در زمان انجام اين پروژه ، به اواسط فصل توليدمثل نزديك شده در نتيجه اندازه گيري ميزان ATP اسپرم ماهي كفال طلايي در دوره هاي نگهداري كوتاه مدت 5 و 10 روزه انجام شد كه در صورت عدم وجود اين محدوديت هاي زماني ، اندازه گيري ميزان ATP اسپرم درحا اطلاعات محدودي در مورد ميزان ATP اسپرم ماهي و اثرات فاکتورهاي محيطي و شيميايي و بيوشيميايي بر آن وجود دارد.

طبق گزارشات Perchec و همکارانش(10 ) در صورت آلوده نشدن اسپرم به ادرار، ميزان ATP آن حدود اسپرم و در صورت آلوده شدن به ادرار، ميزان ATP آن حدود اسپرم بود. براي اندازه گيري غلظت ATP، لوسيفرين – لوسيفر از ( حل شده در 100mM گلايسين، 20mM Mgso4، PH7/4) را به نمونه افزوده وسيگنالهاي بيولومينوسانس را با استفاده از يک دستگاه
لومينومتر Lmax ، 96 چاهکي (Molecular, Devices Sunngvale,CA,USA) اندازه گيري مي كنند و ميزان ATP هر نمونه را با استفاده از استانداردهاي ATP محاسبه مي كنند
و بصورت Pmol/108 اسپرم بيان مي شود.Ogier وهمکارانش(11)
ميزان ATP را با استفاده از روش بيولومينوسانس(اندازه گيري بيولومينوسانس
Kit ClsII, ATP ،Boehringer-Mannheim ) ، پس از استخراج با يک تري کلرواستيک اسيد2% ، mM2 EDTA، اندازه گيري کردند و بصورت nmol/108 اسپرم بيان کردند. Perchec و همکارانش (10) ميزان ATP را بوسيله روش بيولومينوسانس اندازه گيري کردند به اين شکل که اسپرم ماهي کپور معمولي را به نسبت 100/1 در بافر HEPES جوشان تجزيه کرده و سپس با افزودن لوسيفرين – لوسيفراز به اسپرم، سيگنالهاي لومينوسانس را به وسيله (Biocounter M2010A Lumac/3M) اندازه گيري کردند و سپس ميزان ATP را با استفاده از استانداردهاي ATP محاسبه کردن و بصورت nmol/108 اسپرم بيان کرده اند. در مورد تلقيح مصنوعي گاهي نگهداري اسپرم لازم است . مدت زمان تحرک اسپرم نيز متاثر از دماي نگهداري است بطوريکه طبق گزارشات 12)) نگهداري کوتاه مدت (15 دقيقه) اسپرم در دماي ?C 20، مدت زمان تحرکش را کاهش مي دهد، آنها همچنين مشاهده کردند که ميزان تحرک اسپرم کپور ماهي معمولي پس از 2 ساعت نگهداري در دماي ?C 20 حدود 50% کاهش يافت. نتايج تحقيق اين دو همکار نشان داد که امکان نگهداري اسپرم در يخچال (?C 5 ) تا 24 ساعت براي ماهي کپور معمولي و تا 8 ساعت براي ماهي کپور علفخوار بدون کاهش قابل توجه کيفيت اسپرم وجود دارد. در مورد ماهي قزل آلا Oncorhynchus mykiss ، گزارش شده است که سطح ATP و ميزان حرکت اسپرم اين نوع ماهي بعد از ذوب بطور قابل توجهي کاهش مي يابد. ولي Ogier و همکارانش گزارش کردند که اسپرم گربه ماهي اروپايي بدون کاهش سطح ATP خيلي متفاوت عمل مي کنند. اسپرم منجمد شده گربه ماهي اروپايي با DMA موجب افزايش قابل توجه سطح ATP اسپرم مي شود که اين بدين علت است که DMA موجب تحريک مستقيم سنتز ATP مي شود که اين افزايش سطح ATP در طول فرآيند، احتمالاً يک عامل مهم در تحمل انجماد اسپرم گربه ماهي اروپايي در حالت وجود DMA باشد. ولي نتايج کسب شده از آزمايشات به ما نشان داد که در اين تحقيق بهترين تداوم بخش گليسرول 10% و گلوکز 3M/0 است. ضمنا تحقيق مشابهي در اين رابطه يافت نشده است.